从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
纯种分离的目的是将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养。
如果样品没有经增殖培养而直接进行分离，那么要得到具有某一特性的纯种，就更该细致、谨慎的操作。
倾注平板分离法、涂布平板分离法、平板划线分离法和组织分离法。
倾注平板法:将无自生理盐水稀释后的样品加入无茵培养基混合均匀。待凝固后倒置培养，内部及表面形成单自落。
因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途：一般多用于菌种的纯化；
优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；
控制每个平板中微生物的菌落数在一定的范围可获得理想的分离效果，对于细菌和酵母，以每平板10~200菌落为佳，对于丝状菌，则应控制每平板菌落数30~50或更少。
如果分离菌丝呈蔓延性生长的丝状菌如根霉、毛霉等，则可以在培养基中添加0.1%左右的去氧胆酸钠（去氧胆酸钠在低PH下灭菌过程中易形成絮状沉淀，可以通过分别灭菌、倾注平板前混合的方法避免）或山梨糖（在察氏培养基中加山梨糖0.1%，蔗糖0.01%），这样可防止菌丝蔓延，便于挑取。
经培养后会得到呈分散状态的单菌落纯培养。
最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途：一般多用于筛选菌株；用于平板培养基的回收率计数。
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。
分离时，切取小块受病组织，用10%漂白粉水或0.1%升汞液进行表面消毒，并用无菌水洗涤数次后，移置于培养皿中的琼脂培养基表面上，在适宜的温度条件（25℃~26℃）培养。
受病组织内潜伏的微生物开始生长，经3~5天后，就可以看到从受病组织周围长出菌丝，并向外扩展。
经菌落特征的观察和镜检，确认是所需分离的菌种时，即用火焰灭菌的接种针从边缘挑取少量菌体，移到斜面培养基中培养。
与增殖培养一样，在纯种分离时同样也要根据实际情况对培养基的营养成分和培养条件进行适当的控制，以获得良好的分离效果。