第一法 金黄色葡萄球菌定性检验
称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~ 2min。若样品为液态,吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀。
将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18h~24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊 生长。
将增菌后的培养物,分别划线接种到 Baird-Parker平板和血平板,血平板36 ℃±1 ℃培养18h~ 24h。Baird-Parker平板36 ℃±1 ℃培养24h~48h。
金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm~3mm, 颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰 带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清 晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些, 且外观可能较粗糙,质地较干燥。
在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
1.染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为 0.5μm~1 5 μm。
2.血浆凝固酶试验:挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接 种到5mLBHI和营养琼脂小斜面,36 ℃±1 ℃培养18h~24h。
取新鲜配制兔血浆0.5 mL,放入小试管中,再加入 BHI培养物0.2 mL~0.3 mL,振荡摇匀,置 36 ℃±1 ℃温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现 凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌 菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI,36 ℃±1 ℃培养18h~48h,重复试验。
结果判定:符合4、5,可判定为金黄色葡萄球菌。
结果报告：在25g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
1.7.5%氯化钠肉汤增菌培养：
（1）若样品本身在均质后清澈，培养18h观察呈现一定程度的浑浊（与培养前相比），则接种平板；若18h后仍无变化，继续培养至24h后无论浑浊与否都接种至平板；
（2）若样品本身在均质后浑浊，则直接培养至24h后再接种平板。
2.血平板：36±1℃培养18h后观察，若有菌落生长或有菌落生长的迹象（无论是否溶血），则应酌情配制NA、BHI并分装至小试管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、灭菌后NA应斜放凝固成琼脂斜面备用。至血平板培养至24h取出，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，同时挑取菌落接种至NA斜面、BHI肉汤管，36±1℃培养24h。
（1）革兰氏染色后还剩余10个或10个以上菌落，则NA、BHI分别接种5管；
（2）若多于5个（不包括5个）不足10个，则BHI接种5管，剩余的接种NA；
（3）5个及以下则全部接种BHI，不接种NA。
36±1℃培养24h后观察，有菌落生长则取出，无菌落生长则继续培养至48h后再观察。若血平板已挑取菌落进行证实试验，则不必再挑取BP平板上的菌落进行实验。若血平板上无菌落生长，则应在24h～48h内逐步观察BP平板是否长菌或有无长菌迹象，有则需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落进行纯化、增菌，36±1℃培养24h。
（1）根据BHI管数，取冻干血浆粉，每瓶用移液枪加入0.5mL生理盐水，使其充分溶解，再换移液枪枪头取0.3mLBHI培养物加入其中（每管BHI用1个枪头），振荡摇匀后于36±1℃培养，计时，每30min观察一次，如呈现凝固（将试管倾斜或倒置时出现凝块）或半凝固（一般的液体呈现凝固）则判定为阳性。若一直不凝固，则一直观察，直至观察至6h（查看12次）还未凝固，则试验终止，判定为阴性结果；若中途出现完全凝固或半凝固，则试验终止，判定为阳性结果。
（2）同时取金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌悬液后作为阳性对照、以灭菌生理盐水为阴性对照，分别接种至BHI中同步培养后进行血浆凝固酶试验。
（3）若血浆凝固酶试验结果可疑，则挑取NA上的菌落接种BHI再次进行试验。
第二法 金黄色