建立培养基适用性检查操作规程,保证培养基的质量,确保检验结果的准确性。
本规程规定了培养基适用性检查方法和操作要求,适用于微生物实验室计数用培养基、控制菌检查用培养基的适用性检查。
1.1 培养基适用性检查试验可用于确定实验室所使用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基、按处方自行配制培养基所用不同批次的原材料等)、制备程序(包括水质控制、配制方法、灭菌程序等)、保存条件(温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等)等是否满足微生物限度检查要求。
1.2 计数用培养基适用性检查包括需氧菌、霉菌及酵母菌总数计数。
1.3 控制菌检查用培养基适用性检查包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。
2 计数用培养基适用性检查
微生物限度检查中计数用培养基有5种,胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、R2A琼脂培养基、平板计数培养基。
2.1.1 培养基:胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂对照培养基;沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂对照培养基;R2A琼脂培养基、R2A琼脂对照培养基;平板计数培养基。
2.1.2 配制:照《培养基配制标准操作规程》配制。
2.2 试剂及稀释剂配制
2.2.1 试剂:pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、聚山梨酯80、氯化钠。
2.2.2 稀释剂配制
Ø pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液:称取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液14.63g,加水1000mL溶解,分装,灭菌(121℃、15min)。
Ø 0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液:取已经灭菌好的聚山梨酯80(1mL),加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,摇匀,即得。
Ø 0.9%无菌氯化钠溶液:称取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000mL,分装,灭菌(121℃、15min)。
新洁尔灭溶液、84消毒液、苯酚、75%医用消毒酒精。
3.2.1 84消毒液:取84消毒液1ml,加水60ml(1:60),摇匀即得。
3.2.2 0.1%新洁尔灭溶液:取新洁尔灭溶液20.4ml,加水至1000ml,摇匀,即得。
3.2.3 5%的苯酚溶液:称取苯酚5g,加水至100ml,摇匀,即得。
3.2.4 75%酒精棉球:取灭菌脱脂棉撕成小块并揉捏成团,置于广口瓶内,加入75% 医用消毒酒精,充分浸润,即得。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]
枯草芽孢杆菌(Bacillus s aureus)[CMCC(B)63501]
白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]
4.2.1 仪器与用具
Ø 仪器:生化培养箱(30~35℃)、霉菌培养箱(20~25℃)、恒温水浴锅。
Ø用具:酒精灯、打火机、吸耳球、试管架、大试管(20×200mm、15×200mm)、锥形瓶、硅胶塞、刻度吸管(1mL、2mL、5mL/10mL)、吸管桶、接种环、培养皿(90mm)、不锈钢培养皿桶、不锈钢吸管桶、玻璃专用笔。
5.1 金黄色葡萄球菌菌液制备方法
5.1.1 用无菌接种取金黄色葡萄球菌斜面中底部菌落一环,在装有pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL的试管内壁上轻轻摩擦,使环上的菌苔全部洗于溶液中,振摇混匀。
5.1.2 用1ml无菌吸管吸取上述均匀菌液0.1mL加入装有9.9mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中,混匀,作为10-1级。
5.1.3 以此类推,10倍递增稀释至每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液,备用。
5.2 枯草芽孢杆菌菌液制备方法
照金黄色葡萄球菌菌液制备方法同法操作。
5.3铜绿假单胞菌菌液制备方法
照金黄色葡萄球菌菌液制备方法同法操作。
5.4 白色念珠菌菌液制备方法。
5.4.1 用无菌接种取白色念珠菌斜面中底部菌落一环,在装有pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml的试管内壁上轻轻摩擦,使环上的菌苔全部洗于溶液中,振摇混匀。
5.4.2 用1ml无菌吸管吸取上述均匀菌液0.1ml加入装有9.9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中,混匀,作为10-1级。
5.4.3 以此类推,10倍递增稀释至每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液,备用。
5.5 黑曲霉液制备方法
5.5.1 取黑曲霉的斜面一支,加入20ml含0.05%(ml/ml)聚山梨